cromatografìa

sf. [sec. XX; cromato-+-grafia]. Tecnica di analisi chimica strumentale, di cui sono state sviluppate molte varianti, che consente di separare tra loro i componenti presenti in una miscela e, inoltre, di identificarne la natura e determinarne la concentrazione. La caratteristica peculiare di questa ampia classe di metodi analitici sta nella loro capacità separativa, che li connota e li distingue dalle altre tecniche. Una volta realizzata la separazione, l'identificazione dei composti e la determinazione delle loro concentrazioni può essere realizzata con tecniche e strumentazioni di varia natura (per esempio, di tipo spettroscopico o elettrochimica). La separazione dei componenti si basa sul principio della separazione tra fasi: in tutti i metodi cromatografici, la miscela viene disciolta in una fase (un liquido, un gas o un fluido supercritico) che viene fatta fluire (ed è perciò detta fase mobile) attraverso un'altra fase tenuta fissa (fase stazionaria). In ragione della diversa affinità relativa che i vari componenti possiedono per le due fasi, essi tenderanno a fissarsi più o meno rapidamente e più o meno fortemente alla fase stazionaria, e perciò si posizioneranno in zone distinte di quest'ultima: i componenti che mostrano maggiore affinità per la fase stazionaria si raggrupperanno nella regione iniziale di questa, gli altri via via più avanti, in modo da risultare alla fine separati. Sebbene esistano vari criteri per classificare le diverse tecniche cromatografiche, la classificazione più generale si basa sulla natura delle due fasi. § In base alla natura della fase mobile si ha così una prima grande suddivisione in cromatografia in fase liquida, cromatografia in fase gassosa (o gascromatografia) e cromatografia con fluido supercritico. In base alla natura della fase stazionaria, e quindi del processo mediante il quale ha luogo la separazione, si ha poi l'ulteriore suddivisione in cromatografia liquido-liquido, cromatografia liquido-fase legata (in cui la fase stazionaria è costituita da composti organici legati sulla superficie di una terza fase, solida), cromatografia liquido-solido (o per adsorbimento), cromatografia per scambio di ioni (dove la fase stazionaria è costituita da resine scambiatrici di ioni), cromatografia di esclusione dimensionale, cromatografia gas-liquido, gas-fase legata e gas-solido. Nell'ambito della cromatografia liquida, si indicano con la sigla HPLC (High Performance Liquid Chromatography) le metodiche più moderne, basate sull'uso di fasi stazionarie costituite da particelle di dimensioni ridottissime (pochi micron). I metodi HPLC rappresentano oggi la famiglia di tecniche analitico-separative in assoluto più diffusa nei più svariati campi applicativi. Storicamente, le prime separazione cromatografiche (M. S. Tswett, 1903) furono realizzate su miscele di pigmenti vegetali colorati (da cui il nome della tecnica) che venivano disciolte in un solvente e fatte scendere per gravità lungo una colonna riempita con carbonato di calcio finemente suddiviso (si trattava perciò di una cromatografia per adsorbimento), in modo tale che i componenti si separavano dando origine a una serie di anelli colorati. Asportando separatamente dalla colonna i diversi anelli colorati ed estraendo il materiale adsorbente con un adatto solvente, si ottenevano così, pure e separate, le diverse sostanze che costituivano la miscela. Nelle tecniche cromatografiche oggi in uso, una volta che le sostanze sono state separate lungo la fase stazionaria, esse vengono ricuperate per eluizione, cioè facendo fluire lungo quest'ultima una corrente di fase mobile, costituita da un solvente o da una miscela di più solventi di polarità opportuna (o da un gas nella gascromatografia). Se l'eluente ha una composizione fissa si realizza una eluizione isocratica, se invece si impiegano miscele di più eluenti facendone variare lentamente la composizione si realizza una eluizione con gradiente. Nel corso dell'eluizione, le sostanze si spostano con velocità diversa lungo la fase stazionaria, e alla fine fuoriescono separate dalla coda alla colonna, da dove vengono poi indirizzate verso il sistema di rivelazione che le identifica e le determina quantitativamente. La separazione raggiunta dipende quindi non solamente dalla diversa affinità degli analiti per la fase stazionaria, ma anche (e anzi soprattutto) dalla diversa affinità per la fase mobile, la cui scelta è dunque critica. In questo aspetto la cromatografia liquida differisce notevolmente dalla gascromatografia, nella quale l'eluizione avviene mediante un gas carrier chimicamente inerte, e dunque l'efficacia della separazione dipende sostanzialmente dal tipo di fase stazionaria impiegata. La fase stazionaria può essere contenuta in una colonna (come negli esperimenti originari di Tswett) oppure può essere supportata su una superficie bidimensionale, nel qual caso si ha la cromatografia di superficie, o infine, più modernamente, in un sottilissimo capillare. Le applicazioni della cromatografia su capillare, limitate tradizionalmente alla gascromatografia, sono state estese recentemente anche alla cromatografia liquida, e hanno vari vantaggi, tra i quali il fatto che consentono di effettuare analisi con quantità minime di campione. I tipi di cromatografia più diffusi sono quella liquido-liquido e quella liquido-fase legata (soprattutto nelle varianti moderne a elevata prestazione HPLC), che nel loro insieme sono indicate come cromatografie per ripartizione. Nel primo metodo, la fase stazionaria liquida è immobilizzata su particelle solide mediante adsorbimento fisico, nel secondo (divenuto largamente predominante) la fase stazionaria è legata chimicamente sul supporto solido (che è spesso costituito da silossani contenenti gruppi funzionali opportuni). Quando la fase mobile è un solvente non polare (esano, isopropiletere) e la fase stazionaria è polare (per esempio, acqua o trietilenglicole supportati su silice o allumina) si parla di cromatografia per ripartizione in fase normale; quando invece la fase mobile è polare (acqua, metanolo, acetonitrile o miscele di questi solventi) e quella stazionaria è non polare (spesso un idrocarburo) si parla di cromatografia per ripartizione in fase inversa. Queste denominazioni sono legate principalmente a motivi storici; oggi la cromatografia in fase inversa è quella più largamente impiegata. In questa variante, il primo componente a eluire dalla colonna è il più polare (meno trattenuto nella fase stazionaria e più solubile in quella mobile). Le tecniche di rivelazione usate nell'HPLC sono di vario tipo: spettroscopia di assorbimento nell'ultravioletto o nell'infrarosso, fosforescenza, misura dell'indice di rifrazione, diffusione della luce (previa nebulizzazione dell'eluito), metodi elettrochimici (amperometria, voltammetria, conduttometria). L'evoluzione più recente delle tecniche cromatografiche si basa sullo sviluppo di metodiche nelle quali l'apparecchiatura cromatografica (usata a scopo separativo) viene accoppiata in serie con una seconda strumentazione (o talvolta con più di una strumentazione) che provvede ad analizzare le sostanze in continuo. Per queste metodiche, dette accoppiate o ifenate, vedi la voce ifenato. § La cromatografia per scambio di ioni, introdotta negli anni Cinquanta del sec. XX e poi largamente usata, si basa su fenomeni di salificazione tra un acido o una base macromolecolare e insolubile, cioè tra una resina scambiatrice di ioni e i cationi o gli anioni contenuti nella soluzione che attraversa la colonna di resina scambiatrice. Così, se si fa attraversare una colonna di resina acida da una soluzione che contenga un sale di calcio e uno di sodio, il calcio, che presenta una tendenza maggiore del sodio a fissarsi sulla resina, viene trattenuto dagli strati superiori della colonna, mentre il sodio si fissa più in basso; facendo poi passare attraverso la colonna un acido forte diluito, in genere il cloridrico, il calcio e il sodio discendono lentamente lungo la colonna, gradualmente liberandosi dallo strato di resina nel quale erano fissati e andando a fissarsi in quello successivo. Durante questa migrazione lungo la colonna essi si distanziano sempre più: a un certo momento il liquido che esce dal fondo della colonna trascina con sé tutto il sodio; segue una certa quantità di liquido che non contiene né sodio né calcio e infine esce dalla colonna il calcio. Scegliendo le condizioni adatte, si possono separare tra loro i costituenti di miscele anche molto complesse, come per esempio le miscele di dieci o quindici amminoacidi che si ottengono dall'idrolisi delle proteine: la cromatografia su colonna di resina scambiatrice di ioni costituisce infatti il metodo di impiego più frequente per l'analisi delle miscele di amminoacidi delle proteine, che si attua in apparecchiature completamente automatizzate. Nella cromatografia di esclusione dimensionale si fa uso di una fase stazionaria costituita da piccole particelle di silice o di polimeri (per esempio, polistirene tal quale o chimicamente modificato), contenenti al loro interno pori di dimensione uniforme all'interno dei quali possono essere intrappolate le specie da separare. Il tempo di residenza delle specie nei pori dipende dalla loro dimensione: le specie più grandi non riescono praticamente a entrare, e quindi eluiscono per prime, mentre le specie più piccole possono diffondere a lungo attraverso i pori, e fuoriescono per ultime. Nell'ambito di questa tecnica, quando il solvente è acquoso e la fase stazionaria idrofila si parla di cromatografia di filtrazione su gel, quando invece il solvente è non polare (organico) e la fase stazionaria idrofoba, di cromatografia a permeazione di gel. La prima variante può essere usata, per esempio, per separare proteine da amminoacidi o piccoli peptidi, oppure per separare miscele di zuccheri, la seconda per separare miscele di acidi grassi. § Importanti nei campi più diversi della chimica analitica, nelle analisi biologiche, tossicologiche, ecc. sono anche le cromatografie di superficie, cioè la cromatografia su carta, quella su strato sottile e la elettrocromatografia. La cromatografia su carta si attua su fogli di carta porosa, quella su strato sottile su uno straterello di un materiale adsorbente, in genere allumina o gel di silice spalmato su una lastrina di vetro o su un altro supporto. Della cromatografia su carta e di quella su strato sottile si sono studiate numerose varianti, ciascuna adatta per risolvere i problemi analitici di un certo tipo. Nel metodo più spesso usato, detto ascendente, si applica una piccola goccia della soluzione in esame al foglio di carta o allo strato sottile in prossimità del suo bordo inferiore e si immerge poi quest'ultimo in una vaschetta che contiene un adatto solvente. Il solvente sale per capillarità lungo la carta o lo strato adsorbente; le diverse sostanze contenute nella goccia della soluzione in esame vengono trascinate dal solvente che sale e si spostano con velocità maggiore o minore a seconda della loro tendenza più o meno spiccata a essere adsorbite. Dopo qualche tempo si estrae il foglio di carta o la lastrina che vengono esaminati: la macchietta iniziale si sarà spostata dal punto di partenza, ossia dal punto dove si era applicata la soluzione in esame, suddividendosi in tante macchiette, a diversa altezza, quante sono le diverse sostanze contenute nella soluzione stessa. Se le sostanze che si analizzano sono colorate, le macchiette sono direttamente visibili, in caso contrario, si possono osservare, per esempio, dalla fluorescenza cui possono dar luogo sotto una lampada a raggi ultravioletti o spruzzando sul foglio di carta o sullo strato sottile, mediante un nebulizzatore, un adatto reattivo di sviluppo che trasformi le sostanze incolori in altre colorate e le renda così visibili. Confrontando l'ascensione capillare di una data macchietta con quella di opportuni prodotti di confronto disposti sullo stesso foglio di carta o sullo stesso strato sottile, si possono identificare i diversi prodotti contenuti nella miscela in esame. § Nella cromatografia con fluido supercritico la fase mobile è costituita da un fluido che si trova al di sopra della sua temperatura critica, e dunque in fase supercritica. In tali condizioni, alcuni parametri di interesse per le applicazioni cromatografiche (densità, coefficienti di diffusione, viscosità) assumono valori intermedi tra quelli caratteristici del liquido e quelli propri del vapore. Per questo motivo, la cromatografia con solvente supercritico unisce alcuni vantaggi della cromatografia in fase liquida e della gascromatografia. Per esempio, unisce la rapidità tipica della gascromatografia (correlata alla bassa viscosità della fase mobile, che consente di applicare flussi più elevati), con una risoluzione più elevata (legata alla diffusività), sebbene ancora inferiore a quella della cromatografia liquida. Il fluido più usato a questo scopo è il biossido di carbonio (la cui temperatura critica è di circa 31 °C, con pressione critica intorno ai 73 bar). Come rivelatore viene spesso usato quello a ionizzazione di fiamma spesso impiegato in gascromatografia. Uno dei principali vantaggi della cromatografia con fase supercritica consiste nella possibilità di separare e analizzare sostanze con peso molecolare elevato termicamente labili e quindi non facilmente analizzabili con la gascromatografia, e sostanze che non contengono gruppi funzionali tali da renderne possibile la rivelazione con i metodi spettroscopici spesso usati nelle strumentazioni HPLC.

H. G. Cassidy, Fundamentals of Chromatography, New York, 1957; F. Cramer, Cromatografia su carta, Firenze, 1957; E. Lederer, M. Lederer, Chromatography, Amsterdam, 1957; A. Berthillier, La chromatographie et ses applications, Parigi, 1971; Bobbit, Introduction à la chromatographie, Parigi, 1972; G. P. Cartoni, G. Goretti, Cromatografia, Roma, 1986.